PCR: optimisation de la réaction PCR

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Pour réaliser une amplification sélective du fragment d'ADN recherché, l’expérimentateur va  devoir optimiser les conditions expérimentales. Dans les chapitres suivants, vous trouverez quelques informations pour comprendre les critères et les limites dans le choix des différents paramètres.

Les amorces

Dans la mise au point de la réaction PCR, le choix des amorces est crucial. Elles vont avoir un double rôle : en s'hybridant à l'ADN matrice, elles délimitent la région d’ADN à amplifier (étape 2 du cycle) et avec leur extrémité 3'OH libre elles servent d’amorce pour l’ADN polymérase (étape 3 du cycle).

Les oligonucléotides amorces s’hybrident aux extrémités de la séquence qui va être amplifiée, il faut donc connaître les séquences nucléotidiques des extrémités de la région ADN amplifiée. C'est en effet au niveau de ces extrémités que les oligonucléotides amorces vont s'hybrider. Pour faciliter le choix des séquences des deux amorces, des logiciels d’analyse de séquences permettent de vérifier les points suivants :

• des températures de demi-dénaturation (Tm) comparables. Les oligonucléotides amorces doivent s’hybrider à l'ADN matrice dans les mêmes conditions de température, (voir le § "Les températures")
• des séquences qui ne soient pas complémentaires entre elles (en particulier dans la région 3’),
• des séquences qui ne contiennent pas de séquences répétées inversées (pas de repliement intramoléculaire).

Il est alors possible de faire synthétiser les deux oligonucléotides (d'une vingtaine de bases).
Remarque : la synthèse chimique d'ADN permet d'obtenir des oligonucléotides dont l'extrémité 5' n'est pas phosphorylée (5'OH) contrairement aux ADN "dits" naturels. Ainsi, tous les fragments d'ADN amplifiés par PCR sont déphosphorylés à leurs extrémités 5'.

Les températures

Les trois étapes, constituant un cycle de PCR, sont effectuées à des températures différentes permettant de contrôler l’activité enzymatique :

1. l’étape de dénaturation, est réalisée à environ 94°C/95°C, pour une dissociation complète des deux brins d’ADN.
2. l’étape d’hybridation se fait à une température Ta (annealing temperature) qui sera définie selon la nature des amorces (voir plus loin le calcul de Ta). Cette température va déterminer la stabilité des hybrides une fois que l’appariement amorces / matrice est réalisé.
3. l’étape de polymérisation est à 72°C, température de « travail » de l’ADN polymérase thermorésistante utilisée. Au cours de cette étape, les brins complémentaires d’ADN sont synthétisés à partir des extrémités 3’OH libre des amorces hybridées.

Calcul de la température d'hybridation: 
Les températures de dénaturation et de polymérisation sont fixes, seule la température d’hybridation devra être calculée pour chaque nouvelle PCR. Cette température d’hybridation dépend de la séquence en bases des oligonucléotides amorces. Elle est légèrement inférieure (environ de 5°C) au Tm qui est la température de demi-dénaturation. (si les 2 oligonucléotides amorces ont des Tm différents, il faudra prendre le Tm le plus faible pour calculer la Ta, afin de favoriser l'hybridation des 2 amorces).

Ta = Tm - 5°C

Pour calculer le Tm d’un oligonucléotide inférieur à 30 nucléotides, on utilise la relation suivante :

Tm = 2 (A + T) + 4 (G + C)

(où A, T, G et C sont respectivement le nombre de chacune de ces bases dans l’oligonucléotide amorce).

L’ADN matriciel

En théorie une copie ADN de la séquence recherchée est suffisante pour avoir une amplification, il faut cependant tenir compte de la probabilité de « rencontre » des molécules d’ADN matrice avec les amorces. Dans la pratique plusieurs copies sont nécessaires pour avoir un résultat correct. Mais attention, la mauvaise qualité et/ou une quantité trop importante d’ADN matrice peut conduire à une amplification aspécifique, voire à une inhibition enzymatique. Il est possible d’expliquer cette inhibition par la présence de contaminants provenant de l’échantillon ou des réactifs utilisés dans les protocoles d’extraction d’ADN.

L’ADN polymérase

Les premières ADN polymérases utilisées provenaient d'une bactérie thermophile (résistante à des températures très élevées), comme par exemple Thermus aquaticus (Taq polymérase). De nos jours, les enzymes utilisées sont dites recombinantes, ce qui simplifie considérablement leur obtention, et leurs propriétés ont été largement modifiées pour les rendre plus efficaces et plus fidèles.

Le tampon

Le tampon utilisé pour la réaction PCR sert à maintenir stable le pH du milieu réactionnel au niveau optimal pour la Taq polymérase (TrisHCl à pH basique 8,5 à 9). Il contient des cations bivalents Mg²⁺, cofacteurs indispensables pour la réaction de polymérisation avec la Taq polymérase. La présence dans le milieu réactionnel des cations bivalents Mg²⁺ et de cations monovalents (K⁺ ou NH₄⁺) vont neutraliser les charges négatives des groupements phosphates au niveau de l’ADN et ainsi stabiliser les hybrides ADN/ADN. En pratique, la concentration en sel doit cependant rester compatible avec l’activité de l’ADN polymérase.

Conditions expérimentales

En début d’expérience il y a un large excès d’oligonucléotides amorces ainsi que des dNTP en quantité suffisante pour synthétiser les copies d’ADN. La concentration en ADN est très faible. La difficulté en début d’expérience se situera essentiellement au niveau de la probabilité de rencontre des amorces avec l’ADN matrice. Au fur et à mesure de l'avancée de la PCR, les copies d’ADN s’accumulent. Cette augmentation de la quantité d'ADN s'accompagne de modification du milieu réactionnel. La viscosité du milieu réactionnel augmente, les quantités d’oligonucléotides amorces et de dNTP diminuent. De plus, la synthèse d’ADN est accompagnée de la libération de pyrophosphate qui en concentration élevée inhibent l’activité de la Taq polymérase. En fin d'expérience PCR, les conditions expérimentales auront changé jusqu'à devenir de plus en plus défavorables à une bonne activité enzymatique. On peut comprendre alors que le nombre de cycles lors d'une expérience PCR soit limité (généralement entre 30 et 40 cycles).